CLIP紫外交联实验的步骤

蛋白质和 RNA 的相互作用在生命活动中发挥着广泛而重要的作用。在 mRNA 的转录、剪切、出核、定位、翻译和降解等过程中，mRNA要和一系列蛋白质结合并受它们的调控。很多结构性RNA，如核糖体RNA、剪切体RNA、snoRNA，只有和蛋白质形成复合物后才能发挥功能。利用实验手段确定蛋白质结合哪些RNA以及结合的位点无疑是理解该蛋白质功能的重要内容。

CLIP (UV-crosslinking and immunoprecipitation)是研究蛋白质和 RNA 相互作用的重要技术，它利用了蛋白质和RNA在256 nm紫外光照射下会发生共价交联的特性。早在20世纪 60~70年代，人们就发现紫外照射会导致蛋白质和核酸交联，但对光交联的机理目前还不是很清楚。有理论认为核酸的碱基在紫外光照射下会接受单个光子被激发，激发态的碱基可以和数埃范围内的氨基酸通过自由基机制或者电子转移机制发生光交联反应。所有 20 种氨基酸都有可能同核酸发生交联反应，但蛋白质中的芳香族氨基酸以及RNA中的更容易发生交联反应。

Darnell 实验室于 2003 年在研究 RNA 结合蛋白 Nova 时开发了 CLIP 技术，2005 年又改进了部分实验流程 [1-2]。在应用 CLIP 的过程中还出现了多种变体，但所有 CLIP 技术的基本流程都是相似的，图 1 显示的是 CLIP 的一种衍生技术—CRAC 的基本流程，它包括 ：(1) 在体内用紫外光交联蛋白质和 RNA ；(2) 用核酸酶部分降解 RNA，获得合适长度的片段 ；(3) 通过抗体纯化交联的蛋白质 -RNA复合物 (RNP) ；(4) 对 RNA 进行同位素标记和两端接头序列的连接 ；(5) 利用 SDS-PAGE 分离纯化交联的 RNP，降解 RNP 中的蛋白质 ；(6) 通过反转录PCR 获得并扩增相应的 cDNA 用于测序分析。近10 年来，CLIP 技术被广泛应用，并取得了丰富的成果 [3]。CLIP 技术本身在特异性和灵敏度上也在不断地改[4-6]。CLIP 技术同高通量测序相结合，可以在全基因组范围内捕获生物体内真实的蛋白质-RNA 的相互作用，深度获得有价值的序列信息 。的 CLASH 技术还能探测 RNA 和 RNA 相互作用。

但是 CLIP 是较难掌握的一种技术。由于紫外交联的效率很低 (1%~5%)，交联的 RNA 含量很少，只有用放射性同位素标记后才能观测到，很容易被来源于细胞和试剂的非特异 RNA 污染。另外 RNA容易降解，RNA 连接效率低，实验流程复杂 (~100步 ) 等因素都增加了应用 CLIP 的难度。本文主要讨论 CLIP 的基本流程和一些技术细节，并介绍最近一些重要的技术发展，希望对想使用该技术的读者有所裨益。读者如果要深入了解详细的实验流程需要参考其他文献 [1,5-6,8-9]， CLIP 的一些应用实例可以在相关综述论文中找到 。

CLIP紫外交联的基本流程

1.1 紫外交联

在 CLIP 实验中，首先使用近紫外光照射细胞或者组织，在蛋白质和 RNA 之间产生共价交联。利用紫外交联蛋白质和 RNA 有诸多优点 ：(1) 它使用波长 250~270 nm 的紫外光，设备易于获得 ；(2)由于紫外光能穿透数层细胞，交联可以在活体细胞内发生，这保持了体内复合物相互作用的真实状态，甚至能捕捉体内的瞬时相互作用，在体内的交联还避免了细胞裂解和纯化过程中 RNA 的丢失以及形成非特异的蛋白质 -RNA 复合物 ；(3) 可以直接使用天然的核苷酸，不需外加修饰的核苷酸 ；(4) 交联发生在“”的氨基酸分子和核苷酸之间，反映直接相互作用的信息 ；(5) 由于蛋白质和 RNA 之间形成稳定的共价交联产物，在后续纯化交联 RNP 产物时可以使用严苛甚至变性的条件，以减少杂质污染对于结果的不良影响 ；(6) 交联对 RNA 逆转录的影响不大，可能出现的突变还能帮助确定交联位点。紫外交联的效率很低，据估计只有 1%~5% 的RNA 能交联蛋白质。紫外交联的效率同照射剂量相关，在具体操作中，需要通过预实验确定所需的最少照射剂量，以减少辐射损伤对结果可能的不利影响。另外紫外交联能否发生和蛋白质的具体结合方式有关，有些 RNA 结合蛋白无法成功交联 。

做CLIP 实验时，在裂解细胞前*行紫外交联，条件设置为254nm紫外线，150mJ/cm2，40s。

提高交联效率的PAR-CLIP

蛋白质和 RNA 发生紫外交联的频率很低 (1%~5%)，这成了应用 CLIP 技术的主要瓶颈之一。为了提高紫外交联效率，Hafner 等 [5] 利用一些核苷酸衍生物，如 4- 硫 - 脲嘧啶 (4-thiourdine) 的光交联效率远高于普通核苷酸的特性，开发了 PAR-CLIP(photoactivatable-ribonucleoside-enhanced CLIP) 技术。他们用 4- 硫 - 脲嘧啶标记哺乳动物的细胞培养物，使用 365 nm 的紫外光引发交联反应。同传统的 254 nm 紫外光照射天然核酸相比，PAR-CLIP 可以将交联效率提高 100~1 000 倍。在测序结果中他们发现大量 T 突变成 C，推测4-硫-脲嘧啶的第 4位的硫原子交联氨基酸后，造成其碱基形成氢键的方式和胞嘧啶 C 一致，因此这些突变位点提供了的交联位点信息。

CLIP 技术的优势在于能捕获体内原位蛋白质和 RNA 相互作用，共价交联的复合物可以经受严格的纯化过程，从而使得结果更为真实可靠。但CLIP 实验受到紫外交联的低效、非特异 RNA 污染、复杂的实验步骤和 RNA 不稳定性等因素影响。最近的一些技术发展部分克服了这些限制因素的影响，CRAC 技术在变性条件纯化共价交联的复合物而提高了结果的信噪比，PAR-CLIP 利用核苷酸衍生物提高紫外交联效率，而 CLASH 技术显示紫外交联还能捕获 RNA 和 RNA 之间的相互作用。这些新发展拓展了 CLIP 的应用范围，相信未来会看到更多 CLIP 相关技术在蛋白质 -RNA 相互作用的研究中发挥作用。

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本文摘自北京生命科学研究所叶克穷 研究员的文献《利用CLIP技术研究蛋白质和RNA的相互作用》