a的生产工艺流程及操作步骤-维生素发酵技术

、a的概述

1.。的结构

.又称核黄素，在自然界中多与蛋白质相结合而被称作核黄素蛋白。.是由异咯嗪环与核糖构成的，结构式如下：

2.的理化性质

.为黄色或橙黄色结品性粉末，味微苦，熔点约为280℃，是两性化合物，在酸性溶液中稳定，在碱性溶液中不稳定，易被热、光破坏，微溶于水，几乎不溶于乙醇和氯仿，不溶于丙酮、。其水溶液呈黄绿色荧光，在波长565nm、pH4~8之间荧光强。

3.。的生理功能

.分子的异咯嗪环中1位和第10位两氮原子可被还原，在生物代谢过程中有递氢的作用，它与机体内的ATP作用生成黄素单核苷酸（FMN），FMN再与ATP作用，就生成黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），两者是多种脱氢酶的辅酶，是重要的递氢体，可促进生物氧化作用。因此，a是动物发育和许多微生物生长的必需因子。人和动物体缺乏1时，细胞呼吸减弱，代谢强度降低，主要症状为唇炎、舌炎、口角炎、眼角膜炎、皮炎等，所以a还是治疗眼角膜炎、白内障、结膜炎等的主要药物中的员，

4.维生素R.的生产方法

3的分布很广，青菜、黄豆、动物肝脏、肾、心、乳中含量较多，酵母中的含量也很丰富。核黄素虽然广泛存在于动、植物中，但因含量很低，不适宜采用从天然产物中提取的方法制备1的原料。而化学合成法步骤多，成本比数生物发酵法高，所以目前工业上a的生产主要采用微生物发酵法，工艺路线如图5-6所示。

如的岛面制签1刘简现了操被制1利子共签海【中子培别升子海！二种子席狗解鸡子中28：斜面

30℃，35-40h

30℃，20h

1发群！势难水部过湖2.不来，）.些甲府制按素[碳化沉淀润30.160h

3.经基-2-甲酸、黄直盐、ZnsO，

pH2.0-2.5酸化的3-治基-2.禁甲依的核货素旅狗以1核犹意溶奈[您们氧化书站品]核贫本相品0-50℃，浓盐

6070℃

应施，陈][过1，转固过能]….干]过第。

pH6.0-7.0滤被pH5.0-6.0精品601、80日感品图5-6维生表B，发酵生产的工艺路线

二、生产菌种的选育

许多被生物可以产生a，如棉病囊霉、阿氏假囊酵母、酵母、假囊酵母、根霉、曲霉、青霉、梭状芽孢杆菌、产气杆菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等，但真正能用于工业化生产的微生物种类不多。工业上使用的.产生菌主要有阿氏假囊酵母和棉病囊霉，经过菌种改良后，.生产的高水平可达到7000~10000U/ml.，且产品质量好，成本低：

1990年德的BASF公司先使用棉病囊霉作为生产菌株进行核黄素的商业化生产，经过6年的发展，他们终用微生物发酵法取代了化学合成法。

随着分子生物学的发展，基因工程等技术已应用于核黄素生产菌种的育种中。

2000年瑞士的Roche公司采用了基因工程菌种枯草芽孢杆菌用于.的生产，该菌种具有产量高、能耗低等优点，经济效益十分显著。我的广济药业公司是内大的.生产厂，从固外引进了。的高产卤株——枯草芽孢杆i基因工程菌株，发醉水平可达17000~20000U/ml，目前工业生产中常用的核黄素生产菌种见表5-3。

表53核黄素工业生产中的常用菌种

离种名称拉丁名称分类

阿氏假森降母Eremothecium ashbyii酵母酿酒酵母|Saccharom.yces cerevisiae 酵母棉病囊霉

Ashby gossypii霉苗

枯草芽孢杆菌|Bacilus nubrilis胡菌（基因工程菌）

三、培养基成分的选择

1.农子斜面培养基

葡萄糖2g，蛋白胨0.1g，麦芽浸膏5g，琼脂2g，水100mL，调pH6.5。

2.发酵培养基

发酵培养基中以植物油、葡萄糖、糖或大米粉等作为主要碳源，植物油中以豆油对，产量提高的效果为显著，有机氮源以蛋白膝、骨胶、鱼粉、玉米浆为主，无机盐有NaCl、K:HPO、MgSO，.

如果采用少量的葡萄糖和定数量的油脂作为混合碳源时，a的产量可增加4倍。这可能是微生物在油脂的缓慢作用下，解除了葡萄糖或其代谢产物对，生物合成的阻遏作用。在研究烷烃类化合物作碳源时，发现此时菌体合成的易分泌到细胞外，这可能是烷烃类物质影响细胞膜和细胞壁结构的缘故，各种油脂与核黄素发酵单位间的关系如表5-4所示。

表5-4各种油脂与维生素，发酵单位间的关系

油脂名称旅黄素相对产景油脂名称核黄素相对产量对照（无油）|

玉米油

油菜子油420%亚麻籽神

豆油

510%

橄榄油

培养基中常用的氮源有蛋白胨、鱼粉、骨胶等有机氮源。其中蛋白族的品种和质量对a的产量有显著影响，见表5-5。

表55蛋白膝的品种对棉病毒悉合成核黄素的影响蛋白膝品种维生素，产量/（mg/l）动物组织的水解物|1529路航的膜蛋白酶水解物

常用发酵培养基配方：米糠油4g，玉米浆1.5g，骨胶1.8g，鱼粉1.5g，KH:PO，

0.1g，NaCl0.2g，CaCl 0.1g，（NH。）：SO，0.02g，水100ml，

3.前体及刺激剂

嘌呤类化合物作为前体对.的生物合成有促进作用，此外，肌、等对.的生物合成有刺激作用，见表56。

将肌醇与葡萄糖结合起来，并采取半连续滴加的方式培养，可明显提高发酵单位。

表5-6嘌岭类化合物对1生物合成的影响添加的化合物|相对发酵单位

核糖

43%

肌醇

90%

四、菌种的培养及发酵

生产上多采用二种子、三发酵。将阿氏假囊酵母接种于孢子斜面培养基上，于25℃培养9d，然后用无菌水制成孢子悬浮液，接种到种子培养基中，于30℃培养30~40h，种子扩大培养和发酵的通气量要求均比较高，通气般为1：1，罐压为0.05MPa左右，搅拌功率要求比较高。将上述种子液接种到二种子罐中，于30℃培养20h，按2%~3%的接种量将二种子液接种到发酵罐中，发酵培养40h后开始连续流加补糖，发酵液的pH控制在5.4~6.2，温度为30℃，发酵周期为150~160h通气效率高低是影响维生案B。产量的关键，通气效果好，可促进大量膨大菌体的形成，a的产量迅速上升，同时可缩短发醉周期。因此，大量膨大菌体的出现是产量提高的生理指标。如在发酵后期补加定量的油脂，能使菌体再生，形成第二膨大菌体，可进步提高产量。

五、发酵液的预处理及固-液分离

发酵结束后，向发酵液中加入2mol/L的HCI调pH为5~5.5，以释放部分与蛋白质结合的1，再加适量黄血盐和硫酸锌，然后加人，1.4倍量的3-羟基-2-萘甲酸钠，并于70~80℃加热10min，滤除沉淀。

六、提取与精制

将上述滤液用2mol/l.的HCl调pH为2~2.5，于5℃下静置8~12h，将下层悬浮物压斌得3羟基2秦甲酸钠.沉淀，再用等量浓HC]酸化，经离心分离得上清液为.溶液，沉淀为3-羟基-2-蔡甲酸钠（可循环使用）。再向上溶液中加定量的NH，NO，，于60~70℃加热氧化20min，得.氧化物，再加5倍体积的蒸馏水及a晶种，搅匀，5℃结晶过夜，得，粗品。将粗品用适量蒸馏水溶解，加1mol/L的NaOH溶液调pH为5~6，滤去沉淀，向滤液中加适量品种煮沸，结晶过夜，次日滤取结晶，用酸水洗两次，抽干，并于60C烘干，过80目筛得：成品。