纤维素酶的液态发酵生产-纤维素酶的发酵

、能力目标

①能根据老师的讲述，复述纤维素酶的液态发酵牛产流程。

②能参考相关文献，设计并完成纤维素酶的液态发酵生产流程。

二、生产工艺流程

纤维素醇液态发酵法工艺流程如图6-7所示。

|西种斜面|-|都照|-|种子培养|—-|发酵培养|—-|医榨过。||段碎包装（做品）|-干燥||沉淀||高今

圈67纤维素酶液态发酵法工艺流程

三、实训材料

1.菌株黑曲霉菌种。

2.培养基配方

平板培养基：马铃幕200g，葡萄糖20g，MgSO1·7H2O5 g，K:HPO，1.5g，pH白然，琼脂粉8g：

种子培养基同平板培养基，但不加氛脂粉。

发酵培养基：纤维素粉30g，KNO，30g，案乙二醉1g，初始pH6.5，250mL三角瓶装25mL液体培养基。

3.纤维素酶活力别定主要试剂及其配制

（1）浓度为1mg/ml.的葡萄糖标准液

葡萄糖在恒温干燥箱中90℃条件下干燥至恒重，准确称取100mg于150mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入100ml.容量瓶中用蒸馏水定容至100ml，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12~15d）。

（2）3，5-二硝基水杨酸（TDNS）溶液

准确称取DNS6.3g于500mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解后加入2mol/1.NaOH溶液262mL，再加到500mL含有185g酒石酸钾钠（CGH，O；KNa·4H:O，相对分子质为282.22）的热水溶液中，再加结晶酚（CGH，OH，相对分子质为94.11）5g和无水亚硫酸钠（Na?S（），，相对分子质量为126.04）5g，搅拌溶解，冷却后移入1000mL容瓶中用蒸馏水定容至1000mL，充分混匀。储于棕色瓶中，室温放置周后使用，

（3）0.05mol/LpH4.5的柠檬酸缓冲液

A液（0.1mol/L柠檬酸溶液）：准确称取CGH，O·H.O（相对分子质量为210.14）21.014g于500mL.烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

B液（0.1mol/L柠檬酸钠溶液）：准确称取NasCsH。O，·2HaO（相对分子质量为294.12）29.412g于500ml.烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000ml.容量瓶中，然后用蒸馏水定容至1000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

取上述A液27.12mL，B液22.88mL，充分混匀后移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100ml，充分混匀，即为0.05mol/LpH4.5的柠檬酸绥冲液。4℃冰箱中保存备用，用于测定滤纸酶活力。

（4）0.05mol/LpH5.0的柠檬酸缓冲液取上述A液20.5mL，B液29.5ml，充分混匀后移入1000ml。容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀，即为0.05mol/LpH5.0的柠檬酸缓冲液。4℃冰箱中保存备用，用于测定C。酶活力。

（5）0.51%羟甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液精确称取CMC-Na0.51g于100mL烧杯中，加入适量0.05mol/l.pH5.0的柠檬酸缓冲液，然后移入100ml.容量瓶中并用0.05mol/l.pH5.0的柠檬酸缓冲液定容至100mL，用前充分摇匀。4℃冰箱中保存备用，用于测定C.酶活力。

（6）0.5%水杨酸苷溶液

准确称取水杨酸苷0.5g于100mL烧杯中，用少量0.05mol/LpH4.5的柠檬酸冲液溶解后，移入100mlL容量瓶中并用0.05mol/LpH4.5的柠橡酸缓冲液定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用，用于测定-葡萄糖苷酶活力。

4.主要仪器与设备

电热恒温培养箱、净化工作台、紫外可见分光光度计、电子分析天平、水浴振荡器、电热恒温鼓风干燥箱、低速台式大容量离心机、pH测试仪、真空干燥箱等。

四、操作要点

（）摇瓶培养

1.种子倒备

取保存于4℃冰箱的纤维素酶产生菌种（绿色木霉或里氏木霉）移植于斜面培养基上32℃培养4~6d，以长满黑色孢子为准。

在250mL三角瓶中装入30ml种子培养基，接入环斜面菌种，32℃，150r/min旋转摇床培养24h供作种子，

2.棕叛培养

在250ml.三角瓶中装入25ml.发酵培养基，接种量为10%（体积比），32℃、150

t/min旋转摇床培养5d，

（二）发酵罐培养

1.发酵前处现

10L发酵罐装入6L发酵培养基，灭菌。按照10%接种量接种二种子（在摇瓶培养种子制备基础上再扩大培养次）。

2.培养条件

温度为30~32℃，通气比为1：（0.7~1），搅拌速度为250~400r/min，溶解氧饱和度控制在30%。通过加入2mol/1.的氨水来自动控制发酵液的pH为4.0，若pH下降速度变慢，可适当加入定量的木质纤维，当发酵液pH不再下降或回升，且发酵液黏稠度明显降低时可作为终止发酵的根据。

（三）纤维秦酶液制备

取培养液于4000r/min离心20min，除去菌体及培养基，上清液再用抽滤瓶减压过滤，法液即为粗酶液，取粗酶液1ml，加0.05mol/l柠檬酸缓冲液至10mL，即为稀释10倍的原酶液，可用来测定酶活力。

（四）葡萄糖标准曲线的制作

绘制标准曲线时，可参考表61。

五、活性检验

1.滤纸酶活力的测定

取4支洗净烘干的20ml.具鉴刻度试管，编号后各加入粗酶液0.5ml.和0.05

mol/LpH为4.5的柠檬酸缓冲液1.5mL，向1号试管中加入DNS溶液3mL以钝化酶活性，作为对照，比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5~10min，再各加入滤纸条50mg（新定量法纸，约1cm×6cm），50℃水浴中保温1h后取出，立即向2、3、4号试管中各加入DNS溶液3mL以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为对照调零点，在550nm波长下测定2、3、4号试管液的吸光度A5n0，并记录结果。

根据3个重复吸光度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出滤纸酶活力。在上述条件下，每小时由底物生成1umol葡萄糖所需的酶定义为个酶活力单位（U）。

法纸商活力（U/ml）-鱼萄糖育量理常》兴原应意定容总你程（雪上）×5.56反应液中酶液加入量（mlL）又时间（h）式中：5.56为1mg葡萄糖的物质的量（umol）。

2.C醉活力的测定

4支洗净烘干的20mL.具寨刻度试管，编号后各加入脱脂棉50mg，加入0.05 mol/T.

pH为5.0的柠檬酸缓冲液1.5mL，并向1号试管中加入DNS溶液3ml以铸化酶活性，作为对照，比色时调等用。将4支试管同时在45℃水浴中预热5~10min，再各加入酶液0.5mL，45℃水浴中保温24h.取出后立即向2、3、4号试管中各加入DNS溶液3ml以终止酶反应，充分摇匀沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为对照调零点，在550nm波长下测定2、3、4号试管液的吸光度并记录结果。

据3个重复吸光度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出

.酶活力。在上述条件下反应24h，h底物生成1umol葡萄糖所需的聘量定义为个酶活力单位（U）。

CG即活力（U/mL）-葡萄糖拿量（期保杀原盛演定容总梦基（雪）×5.56反应液中酶液加入诚（mL）X时间（h）

3.C.海活力的测定

取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入0.51%CMC柠檬酸缓冲液1.5ml，并向1号试管中加入DNS溶液3ml.以钝化酵活力，作为对照，比色时调零用。将4支试管在50℃水浴中预热5~10min，再各加入粗酶液0.5mL，50℃水浴中保温30min后取出，立即向2、3、4号试管中各加入DNS溶液1.5mL以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为对照调零点，在550nm波长下测定2、3、4号试管液的吸光度值并记录结果。

据3个重复吸光度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出Ca嗨活力。在上述条件下，每小时由底物生成1umol葡萄糖所需的酶量定义为个醇活力单位（U）。

C.酵活力（U/mL）-葡萄树含量（mg）×反应液定容总体积（mL）×5.56反应液中晦液加人量（mL）×时间（h）

六、实训报告

写出书面报告，并着重分析实验存在的问题，包括成功的经验和失败的教训。

七、实训思考题

1.为什么用产物的生成量来定义酶活力单位面不用底物减少量来定义？

2.DNS为什么能钝化纤雄素酶活力？

3.为什么在测定C.酶活力和Ca海活力时要稀释酶液？