固定化细胞的制备-新型发酵技术固定化细胞

所谓固定化细胞技术，就是将具有定生理功能的生物细胞，例如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等，用定的方法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的门技术。固定化细胞与固定化酶技术起组成了现代的固定化生物催化剂技术。

早在19世纪初叶，人们就利用微生物细胞在固体表面吸附的倾向而采用滴滤法来生产醋酸，后来又有人用类似方法来进行污水处理。现代的固定化细胞技术是在固定化酶技术的推动下发展起来的。1973年，口本在工业上成功地利用固定化微生物细胞连续生产l大冬氨酸，固定化细胞技术受到广泛重视，并很快从固定化休止细胞发展到固定化增殖细胞。如今，在生产菌种方面已很少有未被涉足过的研究域了。

香、任务固定化细胞的生产细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，它免去了破碎细胞、提取酶等步骤，直接利用细胞内的酶，因而固定化酶活力基本没有损失：此外，由于保留了胞内原有的多酶系统，对于多步催化转换的反应优势更为明显，而且无须辅酶的再生。但在选用固定化细胞作为催化剂时，应考虑到底物和产物是否容易通过细胞膜，细胞内是否存在产物分解系统和其他副反应系统，或者说虽有这两种系统，但是否可事先用热处理或pH处理等相应的措施消除。

固定化细胞的制备方法有无载体法、吸附法、共价结合法、交联法、包埋法等。

1.无载体法

细胞可以在没有载体的情况下借助物理方法或化学方法将细胞直接固定化。这种固定化可以发生在细跑结构上，也可以通过细胞案集来完成。例如微生物细胞可以通过加热、冰冻等物理手段进行固定化，也可以应用柠檬酸、各种絮凝剂、交联剂和变性剂等处理达到固定化，这种处理的原理包括：使菌体内起破坏作用的蛋白酶等变性，防止目的酶被水解；使细胞结构固定，避免目的醇逸漏；使菌体聚集，促进较大的菌体颗粒形成。这些方法制备的固定化细胞般只能用于完成单酶或少数几种酶催化的反应。例如白色链霉菌含有胞内葡萄糖异构酶，当在50℃以下保温时细胞会发生自溶，造成酶的渗出；但如果先在60~80℃加热处理10min，就会使发生自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶不会因为这种处理导致酶的明显失活。

除了上述物理方法、化学方法固定菌体外，也可以直接用霉蓝孢子作为固定化细胞，这时孢子中的酶活力比菌丝体高3~10倍，而且可以长时间保存。

无载体法的优点是可以获得高密度的细胞，固定化条件温和，缺点是机械强度差。

2.吸附法

很多细胞都有吸附到固体物质表面或其他细胞表面的能力，这种吸附能力有的是天生具有的，有的是经过处理诱导产生的，依靠这种吸附能力已经发展出许多价廉而又有效的固定化细胞的方法，吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂为载体，将细胞吸附到载体表面上使之固定化。

不同的载体要求的吸附条件不同，如用硅藻土或氢型皂土吸附时要求pH为3，而用氛型皂土吸附时要求pH为5。近年来，引起人们更多关注的是大孔陶瓷吸附剂，如英际陶瓷公司的C、C2，其比表面积为4~25m2/g，每颗粒有众多小孔，平均孔径为90

nm，便于细胞与营养物、底物、产物的接触和流动。另外，刀豆蛋白对细胞表面的糖蛋白具有专的吸附作用，也可以用于细胞的固定化，成为种新型的吸附剂，可以吸附碑酒酵母、假丝酵母等。

离子吸附法的原理是细胞在解离状态下可因静电引力（即离子键合作用）而固着于带有相异电荷的离子交换剂上，如TDEAE纤维素、CM-纤维素等。

吸附法的优点是操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及其酶活力。缺点是吸附容量小，结合强度低.

3.共价结合法

共价结合法是在细胞表面上的功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。有人用此法将卡尔酵母固定在已活化的多孔玻璃珠上，虽然细胞已经死亡，但仍然保留生产尿酐酸的活性。利用此法制备的固定化细胞，细胞大多死亡。

共价结合法的优点是细胞与载体之间的连接很牢固，使用过程中不易发生脱落，稳定性好；缺点是反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻。

4.交联法

交联法是指用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。交联法与共价结合法样，都是靠化学结合的方法使细胞固定化，但交联法采用的是交联剂。如采用戊二醛或偶联米胺等带有两个或两个以上的多功能团交联剂与细胞进行交联，可形成固定化细胞，但反应条件激烈，对细胞活性影响大。

5.包埋法

包埋法是将细胞定位于凝胶网格内的技术，是细胞固定化常用的方法，按照包埋材料的结构可分为凝胶包埋和微胶囊包埋，即将细胞包裹于凝胶的数小格子内或半透膜聚合物的超滤膜内。

常用的包埋材料为聚丙烯酰胺、琼脂、海藻酸、胶原、纤维素等，其中聚丙烯酰胺应用得较早、较多，影响聚丙烯酰胺包埋效果的因素较多，如细胞与胶量比、丙烯酰胺单体比、聚合条件、聚合时间以及使用条件等。当菌体与胶比为10%时，凝胶能够保留简单节杆菌的甾醇脱氢酶活力达40%，而上述比值小于5%时凝胶儿乎不显示该酶的活力。近年来，又发展了其他几类十分有用的包埋剂，如对Y射线等敏感的聚合胶、乙烯吡咯烷、、聚a-羟基丙烯酸等；对光敏感的交联聚合树脂、聚乙二醇丙烯酸酯（PFGM）以及聚氨甲酸乙酯衍生物等。PEGM两端的丙烯酰基对光具有敏感性，与酶液混合后，在光增敏剂存在下光照数分钟就可聚合得到固定化酶。这些物质包埋菌体都显著优于聚丙烯酰胺，因为聚丙烯酰胺单休能引起晦的失效。

包埋法的优点是细胞容量大，操作简便，酶的回收率高，制作的固定化细胞球的强度较高，日前被广泛应用；缺点是扩散阻力大，不适于催化大分子底物与产物的转化反应。