技能训练1糖化酶的固态发酵生产-糖化酶的发酵

、能力目标

①根据所学知识，能描述糖化酶的固态发酵生产的大致流程。

②参照相关材料，能完成糖化醇的固态发酵生产过程。

③学会糖化酶酶活力的测定方法。

二、生产工艺流程

糖化酶固态发酵工艺流程如图6-15所示。

|离丽窗种||两次活化||磨性测定单孢子浮液|浸提|原料|[的匀||大|—[冷却|—[接神|—[器瓶培养|

图6-15糖化酶态发酵工艺流程

三、实训材料

1.菌种

黑曲霉变异株：经紫外线和硫酸二乙酯复合诱变而成。

2.培养基

孢子培养基：察氏培养基。

产酶培养基（g/g）：麦获、豆饼粉的比例为311，（NH，）：SO，3%，KaHPO.0.1%，含水量为120%，粉碎度为过60目筛，pH为5。

3.实验仪器与设备

电子天平、pH计、数显式电热恒温水浴锅、立式蒸汽压力灭蔬器、霉菌培养箱、电热鼓风干燥器、净化工作台。

四、操作要点

1.孢子悉浮液的制备

将保存于冷藏柜中的菌株取出，用孢子培养基连续活化2次。再将长满成熟孢子的斜面培养基用无菌生理盐水洗涤，倒入装有玻璃珠的无蓝三角瓶中，再在200r/min的摇床中充分振荡30min，用灭菌后的脱脂棉滤去菌丝片段，制得单孢子悬浮液，用血球计数板计数，将孢子数调整为10°个/mL。

2.棕挽发酵

在500mL的三角瓶中加人配好的产酶培养基，121℃、1.01×10Pa灭菌30min。

冷却后接入2.5mL孢子悬浮液，温度为32℃，在游菌培养箱中培养4~6d（120h左右）。

五、成品活性检验

（）实验原理

薪化型（即淀粉。-1，4-葡萄薪苷酶）有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解a-1，-糖甘键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用次法定量测定，以表示糖化性的活力。

（二）实验试剂

1.0.1mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液

称取醋酸钠（CH，COONa·3H2O）6.7g和冰酷酸（CH:COOH）2.6ml.，用蒸馏水溶解，定容至1000ml。上述冲液应以酸度计或精密试纸校正pH。

2.0.1mol/L硫代硫酸纳溶液

（1）配制

称取（Na?S.O3·5H:O）24.82g和硫酸钠0.2g溶于煮沸后冷却的蒸馏水中，定容至1000mL，即得0.1mol/I.溶液。储存于棕色瓶中密封保存，配制后应放置星期，标定使用。0.05mol/L溶液则用蒸馏水稀释制得。

（2）标定

取在120℃下干燥至恒重的标准重铬酸钾0.25g，精密称量。置于碘量瓶中，加水50mL使溶解，加2g。轻轻振摇使溶解，如1mol/1硫酸溶液40mL摇匀，密塞。

在暗处放置10min后用蒸馏水250ml.稀释，用此液滴定至近终点时，加淀粉指示液3mL，继续滴定至蓝色消失而显亮绿色，并将滴定的结果用试验校正。1mL的0.1mol/L液相当于4.903mg重铬酸钾。根据本液的消耗量与重铬酸钾的用量，计算的浓度。本溶液需每月标定次，3.0.1mol/L磷液称取（KT）36g，溶解在100ml.蒸馏水中，再加入碘（T=）12.98g溶解，定容至1000mL.储存于棕色瓶中。

用标准的0.05mol/1.溶液标定碘液。

吸取10ml.待标定的碘液放入250ml.碘量瓶中，以0.05mol/L.滴定至淡黄色时，加入1%淀粉指示剂1~2滴，继续滴定至无色为终点。GV=2v式中：c为碘的物质的量浓度；ci为的物质的量浓度，mol/L；V，为消耗的体积，mL；V为碘液的体积，ml。

4.0.1mol/L氧化钠溶液

称取4g氢氧化钠（NaOH）加蒸馏水溶解，定容至1000ml。

5.1mol/L硫酸溶液

量取浓硫酸5.6mL，慢慢加入80mL蒸馏水中，冷却后定容至100mL，摇匀，

6.20%氮袭化纳溶液

称取20g氢氧化钠，溶解定容至100ml.

7.2%可溶性淀粉

称取可溶性淀粉2g，然后用少量蒸馏水调匀，缓慢倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至造明，冷却定容至100mL.此溶液需当天配制。

（三）实验方法

1.待测酶液的制备

发酵结束以后，在三角瓶中直接加入适量pH4.6醋酸钠缓冲液，40℃水浴振荡浸提1h后，用4层纱布过滋得粗酵液（用前可用pH4.6酯酸钠缓冲液适当稀释），供测定用，

2.测定

于甲、乙两支比色管中（50mL），分别加入20%可溶性淀粉溶液25mL及0.1mol/L pH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液5mL，摇匀，40℃的恒温水浴中预热（5~10min）。在甲管中加入酶液2mL（酶活力总量为100~170单位），立即记时间，摇匀。在此温度下准确反应1h后，立即各加20%NaOH溶液0.2mL，播匀，将两管取出迅速用水冷却，并于乙管中补加酶液2mL。

取上述反应液5ml放人碘量瓶中，准确加入0.1mol/1.碘液10mL，再加入0.1mol/L氢氧化钠15mL，同时摇晃。暗处放置15min，加入1mol/L硫酸2mL，用0.05mol/L溶液滴定至无色为终点，

（四）实验结果

糖化酶活力单位的定义：在40℃、pH4.5的条件下，1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖所需的酶量为个糖化酶活力单位。

隋活力单位（A-B）c×90.05×号×32.2×n式中：A为所消耗的体积，mL；5为样品所消耗的体积，mL；c为的物质的量浓度；90.05为与1mL1mol/L相当的葡萄糖的质量，mg；1/2为折算成1mL酶液的量；32.2为反应液总体积，mL；n为稀释倍数。

（五）注意事项

①海液制备时，酶液浓度好控制在消耗0.05mol/L（和样品）的差值为3～6ml（以每毫升50~90单位为宜），

②为统起见，可溶性淀粉使用浙江菱湖淀粉厂生产的化学纯试剂配制，如暂不能购买，而需使用其他厂生产的可溶性淀粉时，必须做对照试验，

六、实训报告

写出书面实训报告，并着重分析过程中出现的问题以及解决的办法。

七、实训思考题

1.试着设计糖化酶发酵罐固态发酵生产的大致方案，并分析摇瓶发酵和发酵罐发辞之间的区别。

2.总结整个实验过程中的注意事项。