菌种的来源

微生物是发酵工业生产成败的关键，因此，工业生产用菌种应该满足以下要求：遗传性稳定，可长期保存；对诱变剂敏感；容易产生营养细胞、孢子或其他繁殖体，种子培养时生长旺盛，快速繁殖；能抵抗噬菌体的污染；发酵周期短，毒、副产物少；下游工程易于操作。

具有上述特征的微生物可从自然界中筛选，也可以从有关科研单位或工厂索取。自然界筛选菌种的样品来源主要包括土壤、水、动植物、新鲜或腐烂的食物、昆虫的排泄物等。

、菌种类型

工业发酵生产中常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。

1.常见的细菌

（1）大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli）大肠埃希氏杆菌简称大肠杆菌，是为的原核微生物。革兰氏染色阴性，短杆状，大小为（0.5-1.0）um×3.0um；运动或者不运动，运动者周生鞭毛。多数大肠杆菌对人体无害，是常见条件致病菌。大肠杆菌生长迅速，营养要求低，是早用作基因工程的宿主菌。工业上常将大肠杆菌用于生产脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、及等。此外，些基因工程表达产物，如干扰素、人胰岛素、人生长激素等，已实现大肠杆菌的高密度发酵生产。

（2）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属（Bacilus）。革兰氏染色阳性，大小为（0.3-2.2）umx（1.2-7.0）um；周生或侧生鞭毛；无荚膜；芽孢中生或近中生，大小0.5um×（1.5~1.8）um。菌落形态不规则；表面粗糙，不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种中的员，可用于生产、蛋白酶、核苷酸酶、氨基酸和核苷等。

（3）北京棒状杆菌（Corynebacterium pekinensis）

革兰氏染色阳性，短杆状或小棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝，单个或呈“八”字排列，无芽孢，不运动。北京棒状杆菌是我发酵的主要生产菌种中的员。

2.常见的放线菌

（1）链霉菌属（Streptomyces）

菌丝发达无隔膜，直径约0.4~1um，长短不，多核。菌丝体有营养菌丝、气生菌丝和孢子丝之分。链霉菌属是抗生素的主要生产菌。常用的抗生素，如、、、、、、井冈霉素等，都是链霉菌属产生的次代谢产物。

（2）诺卡菌属（Nocardia）

诺卡菌属又称原放线菌属（proactinomyces）。菌丝体能产生横膈膜，多数种只有营养菌丝，没有气生菌丝。菌落般比链霉菌属小，表面崎岖多皱，致密干燥。诺卡菌主要分布在土壤中，能产生30多种抗生素，如、间型霉素等。此外，有些诺卡菌还用于石油脱蜡、烃类发酵及脯类化合物的转化。

3.常见的酵母菌

（1）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

细胞多为圆形或卵圆形，长宽比约1~2。它是发酵工业上常用的菌种中的员。它除了用于传统的酒类（如啤酒、葡萄酒、果酒和蒸馏酒）的生产之外，工业上还用于酒精的发酵。

（2）产朊假丝酵母（Candida utilis）

细胞呈圆形、椭圆形或圆柱形，大小为（3.5～4.5）um×（7-13）um。它是人们研究多的生产单细胞蛋白的微生物中的员。以无机氮为氨源，以五碳糖或六碳糖为碳源，在培养基中不需添加生长因子，它即可生长。它既能利用造纸工业的亚硫酸废液，也能利用糖蜜、土豆淀粉废料、木材水解液等生产出人畜可食用的单细胞蛋白。

4.常见的霉菌

（1）毛霉属（Mucor）

属接合菌亚门，毛霉目。菌丝无色透明，无横隔，菌落初期为白色，后为灰白色、淡黄色或淡褐色，气生，不产生匍匐菌丝，有孢子囊，能产生孢囊孢子。有性生殖时可形成球形的接合孢子。毛霉中的许多种分解蛋白质能力很强，因此，豆腐乳、豆豉的制作均用毛霉。

（2）根霉属（Rhizopus）

属接合菌亚门，毛霉目。菌丝无色透明，无隔膜，不长气生菌丝，只产生弧形的匍甸菌丝，有假根，有子囊，能产生孢囊孢子。根霉可分泌多种酶，如、蛋白酶等。它常用于酿酒业中淀粉的糖化。

（3）红曲霉属（Monascus）

红曲霉菌落开始为白色，成熟后变为红紫色，能向培养基中分泌红色色素。红曲霉能产生、麦芽糖酶、蛋白酶、柠檬酸、琥珀酸、乙醇，以及天然食用色素，从而用于黄酒、醋、红腐乳等的制作。

（4）青霉属（penicilum）

青霉在自然界中分布很广，是造成水果腐烂、粮食等工农业产品霉变的主要菌。不同菌种可形成不同的代谢产物，如有产的菌种，产的菌种，产柠檬酸、延胡索酸、草酸等有机酸的菌种，产纤维素酶、糖苷酶的菌种。个别青霉菌还能产生致癌的霉菌毒素。

（5）曲霉属（Aspergillus）

曲霉为多细胞菌。菌丝有分隔，营养菌丝大多匍甸生长，无假根，能产生分生孢子。此属在自然界分布广，是引起多种物质霉腐（如面包，煤生物分解及皮革变质等）的主要微生物中的员。其中，黄曲霉具有很强毒性。绿色和黑色的具有很强的酶活性，在食品发酵中广泛用于制酱、酿酒。曲霉在现代发酵工业中用于生产葡萄糖氧化酶、糖化酶和蛋白酶等酶制剂。

二、菌种的分离筛选

微生物是地球上分布广、种类丰富的生物种群。为了适应环境压力，微生物常常能产生许多特殊的生理活性物质，所以微生物是人类获取生理活性物质的丰富资源。微生物菌种筛选包括采样、富集培养、纯种分离、初筛和复筛。

1.采样

采集微生物样品时，材料来源越广泛，越容易获得新的菌种。土壤具备微生物生长所需的营养、水分和空气，是微生物菌种的主要来源。在实际采样过程中，应根据分离筛选的目的，选择不同区域、有机质含量、酸碱度、植被状况的土壤去采集样品。采土样时，先用铲除去表层土，取5~25cm深处的土样10~15g，装入事先准备好的信封或塑料袋，并对其进行编号，记录采样地点、时间、土质等。取样后，应尽早分离，以避免不能及时分离而导致微生物死亡。

同时还可以根据所筛选微生物目的、特殊生理特点等进行采样。如筛选纤维素酶产生菌，可选择有很多枯枝落叶、富含纤维素的森林土；筛选蛋白酶产生菌株，可选择肉类加工厂、饭店排水沟的污泥；筛选产生菌，可选择面粉厂、酒厂、糕点厂等场所的土壤；筛选酵母菌，可选择果园土壤或蜜钱、甘蔗堆积处。在高温、低温、酸性、碱性、高盐、高辐射强度的特殊环境下，往往能筛选到端微生物。温泉、火山爆发处、堆肥处，往往能筛选到高温微生物；南、北地区、冰窖、海洋深处，往往能筛选到低温微生物；海洋底部往往能筛选到耐压菌。

2.富集培养

在自然界采集的土样，是多种类微生物的混合物，目的微生物通常不是优势菌，数量较少。通过富集培养增加待分离微生物的相对或数量可增加分离成功率。富集培养是根据微生物生理特点，设计种选择性培养基，将样品加到培养基中，经过段时间的培养，目的微生物迅速生长繁殖，数量上占了定的优势，从中可有效分离目的菌株。在富集培养中，既可以通过控制营养和培养条件增加目的微生物的数量，也可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，增加目的微生物的相对数量，从而达到富集的目的。如筛选纤维素酶产生菌，可选择以纤维素为碳源的培养基，使目的菌迅速生长繁殖，而其他不能利用纤维素的非目的菌不能生长或生长缓慢。从土壤中筛选芽孢杆菌时，先将样品在80℃加热10min，以杀死不产芽孢的微生物，再进行富集培养，就可以达到目的菌优势生长。

富集培养在那些样品中目的微生物含量较少的情况下是必要的。但是如果样品中已含有较多数量的目的微生物，则不必进行富集培养，将样品稀释后直接在培养基平板上进行纯种分离即可。

3.纯种分离

纯种分离常采用稀释法和划线法。稀释法是将样品先用无菌水稀释，再涂布到固体培养基平板上，培养后获得单菌落。划线法是用接种环挑取微生物样品在固体培养基平板上划线，培养后获得单菌落。稀释法能使微生物样品分散更加均匀，更容易获得纯种；而划线法更简便、快速。

纯种分离中通常使用分离培养基对微生物进行初步的分离。分离培养基是根据目的微生物的特殊生理特性或其代谢产物的生化反应而设计的培养基，可显著提高目的微生物分离纯化的效率。常用的分离方法包括透明圈法、变色圈法、生长圈法和抑菌圈法等。

4.初筛和复筛

在纯种分离过程中，对于有些微生物，可通过代谢产物与指示剂、显示剂或底物的生化反应在分离培养基平板上直接定性分离。对于这类微生物，纯种分离后可直接在琼脂平板上进行初筛。但并不是所有的微生物都可以用琼脂平板定性分离，往往需要采用摇瓶培养法进行初筛，再对生产性能进行测定。初筛要求筛选到尽可能多的菌株，工作量很大，因此，设计种快速、简便的筛选方法往往会事半功倍。

初筛得到的菌株需要进步通过复筛，以获得较好的菌株。复筛通常采用摇瓶培养法，产物的检测通常采用更为精确的定量测定方法。