自然界工业菌种分离筛选程序

良好的落种是微生物发酵工业的基础，在应用微生物生产各类食品时，先遇到的是选种的问题。要挑选出符合需要的菌种，方面可以根据有关信息向菌种保藏机构、工厂或科研单位直接索取，另方面可根据所需菌种的形态、生理、生态和工艺特点的要求，从自然界特定的生态环境中以特定的方法分离出新菌株。其次是育种的工作，根据菌种的遗传特点，改良菌株的生产性能，使产品产量、质量不断提高。三，当菌种的性能下降时，要设法使它复壮。后，还要有合适的工艺条件和合理、的设备与之配合，这样菌种的优良性能才能充分发挥。

自然界工业菌种分离筛选的主要步骤是：采样、增殖培养、纯种分离筛透、生产性能测定等。如果产物与食品制造有关，还需对菌种进行毒性鉴定。

（1）采样

菌种的采样以采集土壤为主。般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多，采园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，采样的对象也可以是植物、物品，某些水域等。采样应充分考虑采样的季节性和时间因素，以温度适中、雨量不多的初秋为好，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活数量较少，暴雨后上壤中微生物会显著减少。采样方式是在选好适当地点后，用无菌刮铲、土样采集器等采集有代表性的样品，如特定的土样类型和土层，叶子碎屑和底殖质，根系及根系周固区域，海底水、泥及沉积物，植物表皮及各部分，阴沟污水及污泥，反刍动物胃内含物，发酵食品等。

具体采集土样时，就森林、早地、草地而言，可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；就水田等浸水土壤而言，般是在不损坏土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5~15cm处的土，将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中，采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等。采好的样品应及时处理，暂不能处理的也应储存于4℃下，但储存时间不宜过长。这是因为旦采样结束，样品中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长，如果要分离嗜冷菌，则在室温下保存样品会使嗜冷菌数量明显降低。

在采集植物根际土样时，般方法是将植物根从土壤中慢慢拨出，浸溃在大量无菌水中约20min，洗去黏附在根上的土壤，然后用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分土即为根际土样。

在采集水样时，将水样收集于100ml干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，应从较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶浸入水中30~50cm处，瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。水样采集完毕时，应迅速从水中取出采集瓶并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶，采集的水样应在24h之内迅速进行检测，或者于4℃下储存。

（2）增殖培养

般情况下，采来的样品可以直接进行分离，但有时样品中所需要的菌类含量并不是很多，而另些微生物却大量存在。此时，为了容易分离到所需要的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，即设法增加所需要菌种的数量以增加分离的概率，可以通过选择性的配制培养基（如添加营养成分、抑制剂等），选择定的培养条件（如培养温度、培养基酸碱度等）来控制。具体方法是根据微生物利用碳源的特点，可选定糖、淀粉、纤维素或者石油等，以其中的种为碳源，那么只有利用这碳源的微生物才能大量正常生长，而其他微生物就可能死亡或被淘汰。对革兰氏阴性菌有选择的培养基（如结晶紫营养培养基、红紫胆汁琼脂、煌绿胆汁琼脂等）通常含有5%~10%的天然提取物。在分离细菌时，向培养基中添加浓度般为50ug/mL的抗真菌制剂（如放线蓝酮和），可以抑制真菌的生长。在分离放线菌时，通常向培养基中加入1~5mL天然浸出汁（植物、岩石、有机混合腐殖质等的浸出汁）作为初分离的促进因子，由此可以分离出更多不同类型的放线菌。放线菌还可以十分有效地利用低浓度的底物和复杂底物（如几丁质），因此，大多数放线蓝的分离培养是在贫瘠或复杂底物的琼脂平板上进行的，而不是在含丰富营养的生长培养基上分离的。此外，为了对某些特殊类型的放线菌进行富集和分离，可选择性地添加些抗生素（如新生霉素）。在分离真菌时，利用低碳氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数、分离和鉴定。在分离培养基中加入定的抗生素如、四环素、、、等即可有效地抑制细菌生长及其菌落形成。抑制细菌的另外些方法有：在使用培养皿之前，将培养皿先干燥3~4d；降低培养基的pH，或在无法降低pH时加入1：30000玫瑰红。抑制细菌的生长，有利于下阶段的纯种分离，

（3）培养分离

通过增殖培养，样品中的微生物还是处于混杂生长状态，因此必须进行分离、纯化。

在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进步应用，而且要控制得细点，好点，同时必须进行纯种分离，常用的分离方法有稀释分离法、划线分离法和组织分离法。稀释分离法的基本方法是将样品进行适当稀释，然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养，待长出立的单个菌落，进行挑选分离。划线分离法要先倒培养基平板，然后用接种针（接种环）挑取样品，在平板上划线。划线方法可用分步划线法或次划线法，无论用哪种方法，基本原则是确保培养出单个菌落。组织分离法主要用于食用菌菌种或某些植物病原蓝的分离。分离时，先用10%漂白粉或0.1%液对植物或器官组织进行表面消毒，用无菌水洗涤数次后，移植到培养皿中的培养基上，于适宜温度培养数天后，可见数生物向组织块周围扩展生长。经观察确认菌落特征和细胞特征后，即可由菌烙边缘挑取部分菌种进行移接斜面培养。

对于有些薇生物如毛霉、根需等在分离时，由于其就丝的蔓延性，易生长成片，很难挑取单菌落。常在培养基中添加0.1%的去氧胆酸钠或在察氏培养基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于单菌落的分离，

（4）筛选

经过分离培养，在平板上出现很多单个菌落，通过菌落形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的半进行菌种鉴定，对于符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜面纯培养。这种从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株，它只是筛选的步，所得菌种是否具有生产上的实用价值，能否作为生产菌株，还必须采用与生产相近的培养基和培养条件，通过用三角瓶进行小型发酵试验得到适合于工业生产用的菌种，如果此野生型菌株产量偏低，达不到工业生产的要求，可以留之作为菌种选育的出发菌袜。