新技术传递----Nicoya 新一代SPR 技术在钙调蛋白与NOS研究中的应用

EF手性对突变钙调蛋白与一氧化氮合酶结合域肽段相互作用研究

Department of Chemistry, University of Waterloo, Waterloo, Ontario N2L 3G1, Canada

一氧化氮合酶(NOS)是一种非常重要的生物小分子NO合成催化酶，一氧化氮合（NOS）包括三个同型酶：神经酶（nNOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。每种酶产生的NO分别用于神经传递、血管舒张和免疫应答。一氧化氮合酶是通过钙调蛋白结构阈将N末端氧化酶结构域和c-末端结合域形成的同源二聚体蛋白。

一氧化氮合酶（NOS）能催化L-生成NO及在几个关键的生理过程中起主要作用，钙调蛋白（CaM）是小的泛素化Ca⁺²偶联蛋白，用于激活（NOS）;钙调蛋白通过EF手性变化与Ca⁺²结合，但钙调蛋白激活NOS的机制还不清楚.

目前用于CaM与NOS 相互作用研究方法较为复杂、耗时。为此，加拿大waterloo大学的John通过niocya 公司开发的LSPR 实时无标记检测技术分析了不同EF手性对突变的CaM与NOS相互作用，对比CaM与NOS 的结合亲和力，对通过简单方法获得的 CaM-NOS作用结果进行了动力学数据不错，揭示CaM通过EF手性对突变激活NOS！ 并将该成果与研究方法在2017化学生物物理学研讨会进行了分享。

CaM是一种体积小且高度动态的,具有催化Ca²⁺结合的蛋白，几乎存在所有真核生物体中，它对激活NOS的活性是必要的。它由一个可变的中心连接子区连接的球状N末端和c-末端结构域构成，每个区域CaM 通过2对EF-手性基序与Ca²⁺结合，可以结合4个Ca²⁺，这些基序对于相互结合及NOS的活性是必须存在的 。

图为：CaM 的Ca2+不同结合状态（A）Apo-CaM (B) HOLO-CaM (C) HOLO-CaM结构紧凑

图为：不同的CaM EF-手性突变后结构示意图

l 根据之前实验获取的一些信息，John团队利用Nicoya 的LSPR 技术产品OpenSPR实时无标记技

术对CaM与NOS的激活机制做检测；实验过程先对经电泳验证过表达的CaM纯化并做了质量鉴定，之后用于与NOS相互作用研究。

CaM纯化后SDS-PAGE 分析结果

蛋白结合分析： 将 NOS固定OpenSPR的纳米金芯片表面，并对CaM做浓度梯度检测，结果导入TraceDrawer分析。

OpenSPR实时检测，梯度稀释后不同浓度检测出野生型CaM对nNOS（红线）和eNOS 肽（紫红线）的结合情况，观察结合、解离及再生的整个过程，结果显示实验曲线稳定及信号显著。

不同突变的CaM 与cNOS结合数据导入TRACE DRAWER 软件分析，获取Koff、 Kon及 KD值，结果如下：

结果显示：CaMcc与cNOS 的亲和力高于wt CaM,相对wt CaM，所有突变型的CaM除了nCaM及CaMcc,与NOS解离速率都加快，并且结果与之前传统方法得出只有CaMc能激活NOS，其他激活效果差或不激活的结果一致，也有效的证明了OpenSPR 在CaM 与cNOS结合研究中的准确性，并且检测方法简单，数据结果丰富，阐述了CaM激活cNOS激活机制是因CaM发生了EF手性对突变，利用这个方法下一步继续验证CaM激活eNOS及iNOS 的机制。

(1)Alderton etal.Biochem.J. (2001)357:593

(2) Babu YS,Bugg CE ,Cook  WJ:J.Mol.Bio.(1988)204:191-204

(3) Spratt.D.E.et FEBS(2006)273,1759-1771