Western Blot实验没有检测到阳性信号的原因

可能原因有①一抗和二抗不匹配②没有足够的一抗和二抗来结合目标蛋白③封闭剂与一抗或二抗有交叉反应④一抗不识别待检物种蛋白⑤抗原量不足⑥组织中目的蛋白含量低⑦转膜不充分⑧洗膜过度⑨过度封闭使目标蛋白不能显色⑩一抗失效 ?二抗受叠氮化纳抑制?检测试剂过期或底物失活。

相应的处理办法分别是①保证二抗与一抗宿主物种相同(如一抗来自小鼠，二抗须为抗小鼠抗体)②使用高浓度抗体，4℃延长孵育时间(如过夜);③使用温和的去污剂如吐温-20或更换封闭剂(脱脂奶粉、BSA、明胶等);④参照况明书，比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应，设置阳性对照⑤保证每条泳道蛋白上样量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照⑥ 浓缩样本使信号zui大化⑦使用可逆染色剂如立春红S检测转膜结果，检查转膜操作是否正确⑧适度洗膜⑨预实验选择合适的封闭剂或缩短封闭时间⑩使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低?避免叠氮化饷和H盯标记抗体起使用?使用新鲜底物。