1.冷冻保存方法:

(1)传统方法:冷存管置于4C10分钟-->-20C30分钟-->-80C 16~ 18小时(或隔夜)-->液氮槽vaporphase长期储存。

-20C不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3C/分钟之速度由室温降至(-80C以下) -120C，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

(3)HAKATA无血清细胞冻存： 加入HAKATA无血清细胞冻存液制成悬液，直接冻于-80°C，可保存≥5年。

2.操作步骤:

(1)冷冻前24-48小时更换半里或全里培养基，使细胞处于指数生长期。

(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚矾(DMSO)至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。

(3)离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少里细胞悬浮液(约0.1m1)计数细胞浓度及冻前存活率。

(4)取与细胞悬液等里的冻存液，缓慢逐商加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液( DMSO醉后浓度为5~ 10%)，使细胞浓度为1~5x 10*cells/ml，混合均匀，分装于已标示*之冷冻保存管中，1~ 2nl/mal,并取.少里细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。