如何利用28色方案，让树突状细胞分群更精细

为什么要研究树突状细胞？

T和B淋巴细胞是适应性免疫系统的基本效应细胞，但APC（抗原递呈细胞）作为其上游，起着守门员的角色，几乎可以启动和塑造任何适应性免疫反应。树突状细胞（DC）就是APC中递呈抗原能力ZUI强的一种。
越来越多的证据表明，DC对于致耐受性或促炎性局部免疫环境是至关重要的，因此，在自身免疫性疾病以及癌症等疾病中，将DC的生物学机制研究清楚，就可能揭示治疗干预的新方法。

那么如何精细分出DC亚群呢？

在过去的十年中，小鼠和人类树突状细胞分类逐渐细化，这在很大程度上得益于流式细胞术和单细胞RNA测序（sc-RNAseq）领域的技术发展。
在此，我们根据新的基于sc-RNAseq的分类，设计了28色方案来深入区分人DC亚群。大致思路如下：

1. 采用CD45以在非淋巴组织样品中区分造血细胞与污染的基质细胞。

2. 为区分DC亚群，用CD11c、HLA-DR、CD141（也称为BDCA-3，标记cDC1）、CD1c（BDCA-1，标记cDC2）和CD123（pDC）。

3. 增加15个表面分子，每个表面分子与炎症性疾病或抗肿瘤免疫的DC功能相关：共刺激分子CD40、CD80和CD86；低亲和力Fc-受体CD16（FccrIIIa）和CD32（FccrIIa/b）；趋化因子受体CCR7和CX3CR1；清道夫受体CD163；补体受体CD11b；CD85k（也称为ILT-3）；BTLA（CD272，也称为B和T淋巴细胞衰减分子）；CD26，CD38和CD172（也称为Sirpa）。

4. 为了更地圈门，加上了排除性的谱系标记物CD3（pan T细胞）、CD14（经典单核细胞）、CD19（B细胞）、CD56（NK细胞）以及CD4和CD8。

5. 结合CCR7和CD45RA，该方案同时可评估T细胞亚群的分化状态。值得注意的是，CCR7也被证明是DC向引流淋巴结迁移所必需的。

❖详细

❖分析步骤详解

步，首先是常规的圈取液流稳定部分、选择单个核细胞区域、排除粘连体、圈选CD45+活细胞区域。

第二步，通过CD16/CD14，圈出CD14+单核细胞和CD14-细胞，接着将CD14-细胞显示在CD19/CD3图上，圈出CD3+T细胞、CD19+B细胞、CD3-CD19-细胞，在这里CD3+T可通过CD4/CD8分为CD4+T、CD8+T、DNT三个主要亚群;

对CD4+T和CD8+T两个亚群，可进一步通过CCR7和CD45RA圈出其中Naive功能状态的亚群；而CD19+B细胞则可继续分析其CD80+的比例。

第三步，对第二步中圈出的CD14-CD3-CD19-部分细胞，进一步用CD56/CD123散点图分析，圈出CD56+NK、CD123高表达的pDC、CD56-CD123low的DC候选群体，接着可根据CD11c/HLA-DR，圈出准确的双阳性DC群体，后根据CD141/CD1c分析DC（不包括pDC）中的三个亚群：CD141+DC、CD1c+DC、DN DC。

第四步，分析pDC、CD141+DC、CD1c+DC、DN DC四个亚群中CD26、BTLA、CD32、CD38、CX3CR1、CD85k、CD11b、sirpa、CD40、CD86、CD45RA的表达水平。

后一步，利用FMO作为设门对照，分析总DC中CX3CR1、CD85k、CD40、CD163、CD86的表达水平。

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