共聚焦显微镜拉姆达堆栈和光谱特征

在概念上类似于在激光扫描共聚焦或反卷积显微镜中使用高数值孔径物镜从较厚的样本中获得的光学截面（或z堆栈），拉姆达堆栈是一个三维数据集，由使用相同样本场的图像收集组成在不同的波段获得，每个波段跨越一个有限的光谱区域，范围从 2 到 20 纳米。相比之下，所有形式的光学显微镜中的典型成像场景都涉及在探测器的整个波长响应带上获取单个图像（或延时实验中的一组连续图像）。本程序将检查 拉姆达 堆栈的光谱分量。

本程序使用从光谱窗口中出现的 EGFP、Alexa Fluor 488 和 SYTOX Green 染色的细胞核捕获的 拉姆达 堆栈中包含的单个光谱轮廓进行初始化。在光谱下方是单个核的伪彩色图像，因为它出现在每个 10 纳米波长带中，发射强度与存在的荧光团的数量成正比。混合光谱的图像显示在程序的右下角。为了操作本程序，请使用拉姆达 Stack Section滑块平移各种波段并观察混合图像以及光谱图中显示的强度比例。可以使用Spectral Profile选择新的荧光团（青色、绿色或橙色）下拉菜单。

为了测量吸收染料、荧光团或带有多个标记的完整样本的光谱，首先将透射光或发射光分散为其组成波长，然后测量每个波长或非常窄的波长带的强度。频谱分辨率取决于每次测量的带宽，并随着采样通道带宽的减小而增加。可以使用多种不同的技术来分散光，并且其中大多数已应用于（至少在原型仪器中）显微镜场景。测量光谱时要考虑的最重要的特性包括分辨率、波长范围和动态范围。光谱分辨率由的波长决定，这些波长可以相互区分，是高精度光谱成像测量的关键参数。光谱范围是指特定测量中的波长总数（实际上是带宽）。最后，检测限和动态范围分别定义了进行测量所需的最小信号电平和特定测量中可区分电平的数量。对于每个荧光团或吸收物质，所有这些值都可以作为光谱曲线的函数而变化。检测限和动态范围分别定义了进行测量所需的最小信号电平和特定测量中可区分电平的数量。对于每个荧光团或吸收物质，所有这些值都可以作为光谱曲线的函数而变化。检测限和动态范围分别定义了进行测量所需的最小信号电平和特定测量中可区分电平的数量。对于每个荧光团或吸收物质，所有这些值都可以作为光谱曲线的函数而变化。

图1 - 32 通道光谱图像拉姆达堆栈采集

图1 中显示了一组典型的光谱图像，这些图像在 6 纳米的连续带宽中获取，波长范围为500 至 692 纳米，以生成包含 32 个图像的 拉姆达 堆栈（在下面详细讨论）。标本是粘附的人宫颈癌（HeLa 系）细胞的培养物，其中 DNA 和 RNA 使用吖啶橙染色，并使用尼康A1 光谱共聚焦成像显微镜系统。图像（512 x 512 像素）使用 32 通道多阳极光电倍增器以每秒 24 帧的速度记录，使用 488 纳米激光激发。如此高的采集速度在活细胞成像中具有显着优势，这得益于的信号处理技术以及与光电倍增管协同工作的快速模数转换电路。