激光扫描共聚焦显微镜拉姆达堆栈基本概念

在概念上类似于在激光扫描共聚焦或反卷积显微镜中使用高数值孔径物镜从较厚的样本中获得的光学截面（或z堆栈），lambda 堆栈是一个三维数据集，由使用相同样本场的图像收集组成在不同的波段获得，每个波段跨越一个有限的光谱区域，范围从 2 到 20 纳米。相比之下，所有形式的光学显微镜中的典型成像场景都涉及在探测器的整个波长响应带上获取单个图像（或延时实验中的一组连续图像）。本程序检查 lambda 堆栈的光谱分量。

本程序以左上角的三个荧光蛋白光谱（ECFP、EGFP 和 EYFP）的图形以及表示针对细胞核、线粒体和肌动蛋白网络的探针的三重标记标本的伪彩色图像进行初始化， 分别。左下角出现一堆 lambda 部分。为了操作本程序，请使用Lambda 堆栈深度滑块检查 lambda 堆栈中的单个图像，这些图像显示在堆栈右侧的窗口中。或者，使用AUTO按钮自动播放堆栈。当呈现不同的部分时，未混合和伪彩色版本同时显示在样本图像窗口中，光谱上方的箭头表示带通区域的位置。

图 1 - 光谱成像 Lambda 堆栈剖析

为了更好地理解 lambda 堆栈概念（在文献中通常也称为图像立方体或光谱立方体），可以沿着波长（zλ）检查横向图像维度（具有坐标xi,yi）中的单个像素位置) 轴。如图 1(a)所示，当从 lambda 堆栈的一端到另一端进行监控时，像素i的强度和/或颜色分别作为荧光发射信号强度和波长的函数而变化。通过在线性图上绘制像素强度与波长的关系（见图 1(b)），空间上位于像素i的特定荧光团的发射光谱轮廓可以很容易地确定。应该注意的是，使用这种技术获得的发射光谱的精度和分辨率是在不同波段收集的 lambda 堆栈图像数量的函数，每个波段的光谱宽度以纳米为单位（较短的带宽产生更高的分辨率），被调查样品的物理质量，以及探测器的光子灵敏度（量子效率）。

在尼康A1 激光扫描共聚焦显微镜上使用三种具有重叠光谱的荧光蛋白在活细胞中获得的 lambda 堆栈的真实示例如图 2 所示。本实验中使用的荧光蛋白标记物是增强型绿色荧光蛋白（EGFP来自水母；507 纳米处的发射）、增强型黄色荧光蛋白（来自水母的EYFP；527 纳米处的发射）和单体版本的草平橙 (mKO)，发射波长为 561 纳米），一种由天然珊瑚蛋白开发的高性能探针。在这种情况下，单个 lambda 堆栈图像在 480 到 640 纳米的 10 纳米波段（图 2（a））中扫描，以生成总共 16 个荧光蛋白混合物的光谱部分。

λ 堆栈的幅图像揭示了样品在 480 至 490 纳米发射范围内的光谱特征，而第二幅图像包含 490 至 500 纳米的发射数据（见图 2（b））。请注意，前两个 lambda 部分中的几乎所有荧光发射都来自 EGFP 的短波长尾部，而 EYFP 在较长波长部分（490 到 500 纳米）中的贡献很小。在接下来的两个 lambda 部分（500 到 510 纳米和 510 到 520 纳米）中，随着 EGFP 的发射达到平台期，EYFP 的贡献稳步增加。在 520 和 550 纳米之间的三个 lambda 部分中，EGFP 信号开始降低，因为 EYFP 发射的贡献在大约 530 纳米处达到值。同样地，mKO 的发射贡献在 540 和 550 纳米之间的波段中变得更加显着。因此，在 550 到 560 纳米波段中，荧光蛋白的相对贡献对于 EGFP、EYFP 和 mKO 分别约为 10%、25% 和 65%。

图 2 - 带有绿色、黄色和橙色荧光蛋白的 Lambda 堆栈

由于 mKO 的发射占主导地位，因此 EGFP 和 EYFP 的发射贡献在最终波长带（560 至 640 纳米）中逐渐减少。回顾一下，λ 堆栈（480 至 500 纳米和 590 至 640 纳米之间）的波长带具有发射贡献，分别由最短和最长波长发射蛋白质 EGFP 和 mKO 主导。λ 堆栈中心的那些波长带（500 到 590 纳米）包含荧光发射，代表所有三种荧光蛋白的一些贡献。如下文将讨论的，混合发射信号在λ堆栈的波长带上的分布可以使用来自每个探针的参考发射光谱轮廓线性分离，以清楚地分离各个荧光蛋白的贡献。