什么是检定、校准和检测？有什么区别？

　　检定：依据检定规程进行，根据检定规程给出合格与否的结论。

　　校准：只是提供记录数据，是否合格由送检人自己判断。

　　检测：主要是指计量器具新产品和进口计量器具的型式评价、定量包装商品净含量的检验。

　　检定是强制性的，是自上而下的一种量值传递过程；校准则是用户自愿的，是自下而上的一种溯源过程。

　　什么是CNAS认可？

　　CNAS认证是“中国合格评定国家认可委员会认证"的英文缩写，是在原中国认证机构国家认可委员会(CNAB)和中国实验室国家认可委员会(CNAL)基础上合并重组而成的，是由认可监督管理委员会批准设立并的国家认可机构，统一负责对认证机构、实验室和检查机构等相关机构的认可工作。

　　【摘 要】 介绍了荧光定量PCR仪（ABI7500）操作规程，总结了其日常维护和注意事项，为其使用提供指导。

　　【关键词】 荧光定量PCR仪 操作规程 维护

　　荧光定量PCR仪将PCR热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况。

　　1 原理介绍

　　实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[1]。

　　荧光染料法：荧光染料能特异性掺人DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加同步[1]。

　　荧光探针法：探针的5 端标记荧光报告基团 （reporter R） 3 端标记淬灭基团（quencher Q），探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成同步[1] [2]。

　　通常，荧光擴增曲线可分为三个阶段，即荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可以在该阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较，在指数期需要设定一个荧光信号的阈值。荧光信号由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数称为ct值。模板的ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，则ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品及其相应的ct值可绘制出标准曲线，测得未知样品的Ct值后，根据标准曲线便可准确计算出该样品的起始拷贝数[3]。

　　2 操作规程

　　2.1 开机

　　2.1.1 依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关，进入Windows界面。

　　2.1.2 接着打开AB7500仪器电源开关，预热10分钟。

　　2.1.3 点击SDS软件。

　　2.2 检测

　　2.2.1 选择File-New-新建，在New Document Wizard窗口中，从Assay下拉列表中选择反应类型：相对定量，定量，等位基因鉴别或阳性阴性实验，从Container下拉列表中选择反应板类型，在Default Plate Name中输入反应板文件名，点击Next，选择需要添加到反应板文件的探针，点击Next，为每个孔探针和任务，单击Finish。

　　2.2.2 在Well Inspector-View-Well Inspector中输入样品名。

　　2.2.3 运行相应的反应类型程序，选择Instrument设定PCR条件。

　　2.2.4 点击Save下拉菜单下的Save As，输入文件名，点击save，关闭设置界面。

　　2.2.5 按压仪器托盘上的按压位，待托盘弹出后，将所需检测反应板放入检测孔位，再次按压托盘使其滑入仪器，点击Start开始检测。

　　2.3 结果分析

　　PCR反应结束后自动保存结果，对扩增曲线进行分析，选择Analysis-Analysis Settings 选择Auto Ct，软件自动为每个反应空生成基线和阈值，也可根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值，Threshold值，点击Analyze进行再次分析。

　　2.4 关机

　　实验结束后取出反应管（切勿打开管盖），顺序关闭AB7500软件、定量PCR仪电源，关闭电脑

　　3 日常清洁维护[4]

　　3.1 每周用无绒布块蘸取75%酒精清洁仪器的表面。

　　3.2 每周使用75%酒精浸泡反应管托架（晾干后放回仪器内）。

　　3.3 每月执行一次背景校准

　　3.4 每半年检查灯具状态。在7500 Software中，选择Instrument-Lamp Status/Replacement以确定卤素灯的状态：Condition显示 Good 表示灯具工作良好，不需更换卤素灯；显示Failed表示卤素灯已坏，需更换； Change Soon表示灯具使用超过2000小时，建议将更换。

　　3.5在PCR仪运行之前或期间，7500 Software可能显示警告，按警告要求进行目标区（ROI）校正、背景校准、光学校准、染料校准、RNase P仪器验证试验等。